志賀氏菌屬通用探針?lè)?qPCR 試劑盒使用說(shuō)明
志賀氏菌屬（Shigella spp.）通稱痢疾桿菌，革蘭染色陰性，是人類細(xì)菌性痢疾的病原菌，以病人和帶菌者為傳染源。志賀菌是重要的腸道病原菌，每年導(dǎo)致quan世界一百多萬(wàn)人死亡。據(jù)調(diào)查，志賀菌在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)廣泛分布是各地衛(wèi)生部門(mén)要重點(diǎn)檢測(cè)的致病菌。因此快速靈敏診斷志賀菌屬具有重要意義，因此快速檢測(cè)志賀氏菌屬具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)?qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門(mén)檢測(cè)志賀氏菌屬的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
產(chǎn)品及特點(diǎn)
1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。
3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)志賀氏菌屬 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。
7.本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
成分
| 編號(hào)
| 規(guī)格
| 包裝
|
2×Probe qPCR MasterMix
| 981201
| 0.5 mL
| 0.5mL 本色蓋
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熒光 PCR 模板專用稀釋液
| 180701
| 1 mL
| 1.5mL 綠蓋管
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超純水
| 210806
| 1 mL
| 1.5mL 藍(lán)蓋管
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志賀氏菌屬 qPCR引物-探針干粉
| yp15-40000-ldd
| 50 次
| 1.5mL 棕色管
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志賀氏菌屬 qPCR 陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7 拷貝/μL)
| pc60908-40000
| 50 μL
| 0.5mL 黃蓋管
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使用手冊(cè)
| 15-40000sc
| 1 份
| 無(wú)
|
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入 162uL 的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 24 個(gè)月。
自備試劑
樣品 DNA。
使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
成分
| 樣品管N+2 個(gè)
| PCR 陰性對(duì)照
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（1-6 管）
|
2×Probe qPCR MasterMix
| 各 10 μL
| 10 μL
| 各 10 μL
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志賀氏菌屬 qPCR引物-探針混合液
| 各 3 μL
| 3 μL
| 各 3 μL
|
N+2 個(gè)待測(cè) DNA 樣本
| 各 7 μL
| 不加
| 不加
|
超純水
| 不加
| 7 μL
| 不加
|
第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號(hào)） | 不加
| 不加
| 各 7μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）
|
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
過(guò)程
| 溫度
| 時(shí)間
|
預(yù)變性
| 95℃
| 5 min
|
PCR 反應(yīng) （45 個(gè)循環(huán)）
| 95℃
| 15 sec
|
60℃
| 40 sec（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)，淬滅基團(tuán)為 MGB）
|
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須無(wú) Ct或 Ct 大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于 40，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果無(wú)Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽(yáng)性。
2024/10/11
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